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制样
一、组织处理：
备物：EP管若干（标记），冰（冰上操作），剪刀、镊子（酒精消毒），称重仪，称量纸，待处理组织
1.-80℃冰箱取出待处理组织（置冰上）
2.剪取组织（约0.02g-20μg）置于EP管
二、样品裂解和蛋白提取
备物：EP管若干（标记），冰，研磨珠，蛋白抑制剂，待处理组织，移液枪
1.EP管内加入μl（RIPA：蛋白抑制剂（50：1））
2.EP管内置两颗研磨珠
3.组织研磨仪处理（预冷4℃，选择相应样品程序）
4.研磨后将上清置于新的EP管内
5.离心仪处理（预冷4℃，10xg/rcf、20min）
6.离心结束后将上清置于新的EP管内，待测
三、BCA蛋白定量
备物：96孔板，移液枪，BCA蛋白定量分析试剂盒，标准蛋白样品（BSA），锡纸，离心管，样品稀释液（PBS），酶标仪
1.在96孔板按样品量布局
2.溶解标蛋，取15μl稀释至μl(μl的pbs)，使最终浓度为0.5mg/ml（涡旋）(1.5mlEP管)
2.按照0.1.2.4.8.12.16.20μl加入稀释标蛋（做复孔），加入pbs到20μl
3.按照布局加入待测样品2μl（涡旋），加入pbs到20μl
4.制备BCA工作液（现配现用），可按所需先将A液加入离心管中，使用时再加B液，混合后涡旋，呈苹果绿（A液:B液=50:1，要考虑损失）
5.每孔加入μlBCA工作液
6.恒温箱37℃避光孵育30min
7.置于测定仪器测吸光度（OD值）（5s震荡，波长）
四.定浓度，配平
备物：EXCEL计算，PBS，loadingbuffer，移液枪，
1.BSA：0，0.，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，
校正OD值（绝对OD值）=其余浓度BSA的OD-浓度为0的BSA的OD
根据标蛋做标准曲线y=ax+b（y为绝对OD值，x为浓度），计算待测样品浓度
R2＞0.99较好
2.绝对OD值=目标蛋白OD值-浓度为0的BSA的OD值
带入标曲，计算目标蛋白浓度=(绝对OD值-b)/a
真正浓度：浓度*10（因为2ul-20ul稀释了10倍）
3.
样品定量体积=一次上样量（70~35u）/真正浓度
应补PBS=体系总体积（根据最小浓度添加的体积及loadingbuffer选择20/15/10μl）-ld体积-定量体积
5×loadingbuffer加入量=体系总体积*1/5
最终浓度=样品蛋白总量/总体积（保持最终浓度一致）（其实就是70~35μg/总体积）
4.（先开机到98℃）98℃煮5分钟，置冰上wb上样使用或置-20℃冰箱保存（不能放太久）
配胶（可使用预制胶，经费紧缺就制胶吧）
一、制作分离胶
备物：玻璃板夹、制胶架、胶条、长板、短板、烧杯（洗净以上用物），移液枪，dd水，30%arcylamide，TrisHCI8.8ph，10%SDS，10%APS，TEMED，无水乙醇
1.装好板子，测漏液情况
2.按所要的目标蛋白的蛋白量选择相应浓度分离胶（80~kda用8%分离胶，25~80kda用10%，15-40kda多用12%，小于20多用15%），按照胶浓度需要量添加试剂入烧杯（混匀，涡旋），添加TEMED前将水倒干净
3.将配制胶液涡旋，加入夹板里到绿色线（不要打完移液枪内的液体，避免气泡）
4.使用无水乙醇压平，静置40min
二、制作5%浓缩胶
备物：制作好的分离胶，移液枪，烧杯，dd水，30%arcylamide，TrisHCI6.8ph，10%SDS，10%APS，TEMED，梳子
1.按需要量添加试剂（混匀，涡旋），添加TEMED前将无水乙醇倒掉，吸干
2.配置胶液涡旋，加入夹板里到短板顶端，斜插入梳子（避免气泡）
3.静置20min
4.拔梳子洗净使用或置冰箱保存（保持湿润）
电泳
一、配制电泳液（可回收使用3-5次）
备物：Tris，甘氨酸，SDS，纯水
二、电泳
备物：制作好的胶，Marker、样品（冰上保存），电泳仪，电泳槽帽子、电泳槽，胶架，电泳液，移液枪
1.制作好的胶洗净，两胶板短板向内夹在胶架上（要对准，不然会漏液，做好标记）
2.将电泳液倒满内槽，外溢出外槽，外槽电泳液低于内槽
3.孔内加样：Marker2μl和样品（根据样品浓度定上样量，需要调整摸索，一般30-70μg），（加样前涡旋，做好标记）
4.将电泳槽与电泳仪连接，80V20min（或条带下降到分离胶即可调整），V80min，
转膜
一、配制转膜液（可回收使用3-5次）
备物：甲醇，Tris，甘氨酸，纯水
二、切割PVDF膜
备物：切割板，刀片，PVDF膜，尺子，笔
与凝胶大小相仿宽4，长8.2（需要摸索）。
三、转膜
备物：电泳后的胶，电泳仪，电泳槽，转膜液，甲醇，多层滤纸，海绵，转移夹，PVDF膜（与凝胶大小相仿），冰，镊子，刮板
1.放置好转移夹-海绵-滤纸浸泡在有转膜液的托盘上（要漫过滤纸层）
2.PVDF膜用甲醇浸泡3min，用镊子夹出（不用手触碰PVDF膜）
3.电泳后清洗胶，用刮板将胶与玻璃板分离出来，将胶切割好后倒扣在黑色板（负极板）上，PVDF膜对准marker放置（用刮板赶走气泡，防止层与层间有气泡），合上，夹紧转移夹
4.黑对黑，放入电泳槽中，倒入转膜液，放冰块，通电转膜，mA，90min（根据蛋白量选择电流，kda较大所需电流要大以及转膜时间要长）
5.转膜过程要放在冰里进行
封闭（有条件就用快速封闭液！！）
备物：脱脂奶粉+TBST/快速封闭液，切割板，尺子，刀片，盒子
1.转膜结束后，取出凝胶和膜，按所需蛋白KDA切割PVDF膜，切左上角做标记
2.将切割的PVDF膜放入相应的格子
3.倒入封闭液，快速封闭液室温摇床10min/脱脂奶粉室温摇床2h
敷抗体
一、一抗孵育
备物：抗体（放置冰上，尽快使用放回冰箱），脱脂奶粉，TBST，
1.配制5%脱脂奶粉，按照说明书以适当比例稀释一抗或自行调整摸索（涡旋）
2.将相应抗体（涡旋）倒入相应盒子中，室温摇床2h/4℃过夜
3.回收抗体（-20℃保存）TBST摇床洗膜3次（8、8、5min）
二、二抗孵育
备物：二抗（放置冰上，尽快使用放回冰箱），脱脂奶粉，TBST
1.配制5%脱脂奶粉，按照说明书以适当比例稀释二抗或自行调整摸索（涡旋）
2.将抗体（涡旋）放入相应盒子中，室温摇床1h
3.1h后回收抗体（-20℃保存）TBST摇床洗膜3次（8、8、5min）
显影
备物：显影试剂，镊子，保鲜膜，转好的PVDF膜，biorad凝胶成像系统
1.在暗室配置好显影试剂，将待测PVDF膜放进去泡2-3min
2.打开机器，喷适量水，放置保鲜膜，放PVDF膜
3.电脑操作
